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核酸檢測(cè)那些事兒

2022-05-13 17:26 來源:DeepTech深科技 次閱讀
 
核酸檢測(cè)那些事兒
  一場(chǎng)突如其來的疫情,讓核酸、抗原、PCR、cT 值等等這些本來專業(yè)度極高的名詞逐步進(jìn)入了大眾視野。今天,小編就為大家科普一下:新冠檢測(cè)的那些事。

  PCR 核酸檢測(cè)到底是什么東東?

  PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 技術(shù)是一項(xiàng)偉大的發(fā)明,沒有 PCR 技術(shù)的發(fā)明,就沒有現(xiàn)代分子生物學(xué)。PCR 技術(shù)將生物學(xué)劃分為了兩個(gè)時(shí)代:PCR 前時(shí)代和 PCR 后時(shí)代。PCR 技術(shù)之父穆利斯(Kary Mullis)也因此獲得了 1993 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR 技術(shù)也徹底改變了遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科,讓人類才得以開展基因檢測(cè)、病毒感染鑒定、遺傳篩查等等重大舉措。

  簡(jiǎn)單來說,PCR 核酸檢測(cè)就是把核酸按指數(shù)級(jí)放大直至能被機(jī)器檢測(cè)識(shí)別到。核酸很小,一個(gè)核酸肉眼無法看到,但如果把核酸放大,1 個(gè)變 2 個(gè),2 個(gè)變 4 個(gè),4 個(gè)變 8 個(gè),當(dāng)變到足夠多數(shù)量時(shí),很大一群核酸就能被檢測(cè)到。因此PCR技術(shù)就是把核酸擴(kuò)增的手段。

  什么是核酸陽性和陰性?

  在核酸檢測(cè)中,通常用陰性和陽性來表示結(jié)果。陽性代表著檢測(cè)到病毒,陰性則代表正常。當(dāng)然所有的事情都不可能如此簡(jiǎn)單的一分為二,此時(shí)就出現(xiàn)一個(gè)問題:病毒的載量有多有少,如何來衡量檢測(cè)到病毒,多少病毒的時(shí)候又會(huì)引起人們發(fā)病。

  答案是通過 CT 值。

  C 是 cycle, T 是 threshold,CT 值代表 PCR 的循環(huán)數(shù)。前面已經(jīng)提到 PCR 技術(shù)是將病毒的核酸進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增,一個(gè)拷貝變兩個(gè)、兩個(gè)變四個(gè)、四個(gè)變八個(gè)等等,直到能被儀器檢測(cè)到。如果 ct 值為 40,那就表示當(dāng)所檢測(cè)的該病毒的核酸被放大了 2 的 40 次方后,它能被被儀器檢測(cè)到。

  所以 ct 值越小,說明不用放大多少倍就能檢測(cè)到病毒,這代表病毒濃度越高,越容易被檢測(cè)到。反之,如果 ct 值越高,代表病毒含量較少?!缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第九版)》提到,處于恢復(fù)期的感染者在核酸 ct 值 ≥ 35時(shí),樣本中未能分離出病毒,密切接觸者未發(fā)現(xiàn)被感染的情況。

  不同的核酸檢測(cè)機(jī)構(gòu)做出來的結(jié)果會(huì)一致么?

  PCR 核酸檢測(cè)有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化流程,這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化流程是經(jīng)過全世界各地科學(xué)家大量的研究?jī)?yōu)化制定的,是同一份 SOP(Standard Operation Protocol)。同時(shí)所有的核酸實(shí)驗(yàn)室,不論大小,都要沿用同樣的技術(shù)要求,實(shí)驗(yàn)室的布局建設(shè)軟裝硬裝也有統(tǒng)一規(guī)范。就連實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作人員也要經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的技術(shù)培訓(xùn),獲得國家認(rèn)可的上崗證書才得以開展工作。這就好比 KFC 的炸雞都是用的同一個(gè)配方,不論是車站的快捷小窗口還是市中心寬敞舒適的堂食,或是宅急送,你總是能吃到同一個(gè)味道的炸雞,不用擔(dān)心會(huì)踩雷。

  因此,不論核酸檢測(cè)是在哪個(gè)機(jī)構(gòu)完成,其結(jié)果都應(yīng)該是一致的。

  為什么初篩陽性要重新采樣進(jìn)行復(fù)核?

  新冠核酸檢測(cè)必須經(jīng)過兩個(gè)流程:首先是檢測(cè)機(jī)構(gòu)的第一次檢測(cè)(初篩),如果是陽性結(jié)果,那么該人員就被成為初篩陽性人員。第二步所有初篩陽性樣本都需要由更高資質(zhì)的機(jī)構(gòu)進(jìn)行復(fù)采復(fù)核,確保每一個(gè)結(jié)果都準(zhǔn)確無誤。

  經(jīng)過重新采樣、重復(fù)檢測(cè)后,有可能判定為新冠核酸陽性,也有可能復(fù)測(cè)結(jié)果是陰性,“可疑樣本”被排除。一般可疑樣本有兩種可能性:一是 CT 位于灰區(qū),二是病毒的某個(gè)單靶標(biāo)基因因?yàn)槟撤N意外情況顯現(xiàn)陽性。

  而在發(fā)生初篩陽性人員時(shí)就啟動(dòng)應(yīng)急處置,是為了充分利用接報(bào)后黃金4小時(shí)的應(yīng)急處置時(shí)間,全鏈條精準(zhǔn)防控,快速處置,盡可能把疫情控制在萌芽狀態(tài)。

  為什么有的人鼻拭子陽?咽拭子陰?甚至還要測(cè)肛拭子?

  由于新冠病毒是經(jīng)呼吸道傳播,因此采集不同部位的標(biāo)本有不同的臨床意義,除了人們熟知的鼻拭子和咽拭子,其實(shí)還有痰液、血液和肛拭子等也可進(jìn)行采集:

  鼻拭子和咽拭子——上呼吸道標(biāo)本

  痰液——下呼吸道標(biāo)本

  肛拭子——消化道標(biāo)本

  血液——抗體檢測(cè)標(biāo)本

  上呼吸道標(biāo)本(鼻咽拭子、口咽拭子)病毒載量在臨床癥狀初期 1-3 天較高,一周后開始緩慢下降,下呼吸道標(biāo)本(痰液)中的病毒載量通常在發(fā)病后 2 周內(nèi)達(dá)到高峰,且病毒載量高于上呼吸道樣本,糞便樣本中病毒載量通常在發(fā)病后 2-3 周達(dá)到頂峰,總體載量低于痰液樣本,血清中抗體在一周以后可檢測(cè)到,同時(shí)還可以判斷過往是否發(fā)生過感染。

  因此最近出現(xiàn)的病例中提到患者有感染癥狀,但呼吸道標(biāo)本新冠核酸陰性時(shí),可進(jìn)行多點(diǎn)多部位多次采集。

  比如,新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New England Journal of Medicine)最近發(fā)表了一篇文章,描述了鼻拭子和咽拭子的病毒載量與疾病進(jìn)展后的關(guān)系,揭示了患者出現(xiàn)癥狀后新冠病毒的病毒載量動(dòng)態(tài)變化,新冠肺炎早期,病毒載量高,隨后逐漸降低。



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  如上所示,鼻拭子樣本中的病毒載量要高于咽拭子樣本,且高病毒載量出現(xiàn)在疾病早期,即出現(xiàn)癥狀后 2 天左右,而后逐漸降低。因此有可能出現(xiàn)鼻拭子檢測(cè)為陽性,而咽拭子檢測(cè)出陰性結(jié)果。

  為什么會(huì)出現(xiàn)抗原陰核酸陽的情況?

  2022 年 2 月 Lancet 上的一篇綜述,表示了抗原檢測(cè)和 RNA 檢測(cè)是發(fā)生在感染的 0~7 天內(nèi),抗原檢測(cè)的靈敏度遠(yuǎn)低于 RNA 檢測(cè),抗原檢測(cè)只能檢測(cè)到 105~106 拷貝數(shù),而 RNA 檢測(cè)可達(dá)到的 102~103 拷貝數(shù)??贵w檢測(cè)通常發(fā)生在感染后的 7~14 天,檢測(cè)包括 IgG 和 IgM。

  由此可見,當(dāng)病毒載量少的時(shí)候,抗原無法檢測(cè)到,而換成高靈敏度的 RNA 檢測(cè)即可檢出,這就是為什么抗原陰核酸陽的原因,同時(shí)也解釋了疾控中心為什么建議抗原和 RNA 檢測(cè)相互補(bǔ)充。

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  多長(zhǎng)時(shí)間會(huì)出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)陰?


  最快 3 天,一般在 7 天,最晚不超過14 天

  根據(jù)美國約翰霍普金斯大學(xué)的研究人員最近發(fā)表在《內(nèi)科年鑒》上的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),通常在出現(xiàn)癥狀的前幾天,得到假陰性結(jié)果的概率可以從第一天的 100% 到第四天的 67% 不等。癥狀開始顯現(xiàn)后,假陰性結(jié)果發(fā)生率在第 5 天下降到 38%,第 8 天下降到 20%,但此后每天又開始上升。換言之,陽性患者可能最快在第四天即開始出現(xiàn)陰性,根據(jù)個(gè)人體質(zhì)、免疫系統(tǒng)及疫苗等綜合情況,各自轉(zhuǎn)陰時(shí)間不一定,但基本在一周內(nèi)會(huì)轉(zhuǎn)陰。

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  圖 | 感染新冠后可能核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性的概率(上)和核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性后感染新冠的概率(下),按暴露后的天數(shù)計(jì)算;CT 值隨時(shí)間變化曲線圖(來源:New England Journal of Medicine)


  轉(zhuǎn)陰的影響因素復(fù)雜,綜合自身免疫系統(tǒng)、是否有基礎(chǔ)疾病、疫苗情況等等,其中免疫系統(tǒng)就像是人體的護(hù)衛(wèi)軍,當(dāng)免疫力強(qiáng)的時(shí)候,病毒就弱,可能很快就會(huì)痊愈,也許睡了一覺起來就陽轉(zhuǎn)陰;而當(dāng)免疫力弱的時(shí)候,病毒就強(qiáng),需要一段時(shí)間的恢復(fù)。

  也正是因?yàn)檫@種病毒和免疫系統(tǒng)的復(fù)雜拉鋸戰(zhàn),所以才需要定期密集采樣檢測(cè),起到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病情的進(jìn)展的效果。

  哪些因素可能會(huì)影響核酸檢測(cè)結(jié)果?

  病毒載量:綜上所述,病毒載量較低時(shí),可能會(huì)發(fā)生無法檢測(cè)到病毒的情況。

  冠狀病毒有可能發(fā)生變異,也可能會(huì)在未來進(jìn)一步影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因?yàn)檫@些測(cè)試是在流行病早期開發(fā)的,而病毒會(huì)隨著時(shí)間的推移而變異,可能會(huì)導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果不匹配。

  采樣方法:在最近報(bào)道的真實(shí)采樣場(chǎng)景中,很多被采者反饋拭子只是在口腔中左右旋轉(zhuǎn),感覺只沾到了口水,并沒有抵達(dá)舌腭弓,被采者也未出現(xiàn)惡心和反射性保護(hù)動(dòng)作,這種采樣大概率沒有采到呼吸道脫落細(xì)胞,因此容易出現(xiàn)漏檢,造成假陰性結(jié)果。


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  標(biāo)本質(zhì)量:標(biāo)本采集后的保存、運(yùn)輸和信息登記等環(huán)節(jié)至關(guān)重要。某一環(huán)節(jié)處理不當(dāng)均會(huì)造成假陽性或假陰性結(jié)果。因此標(biāo)本采集后應(yīng)密封貼碼后,用生物安全轉(zhuǎn)運(yùn)箱送至核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室,注意避免標(biāo)本的傾倒漏灑。信息登記應(yīng)改進(jìn)流程,減少人工登記誤差,多采用計(jì)算機(jī)讀取信息技術(shù)。


  試劑靈敏度:試劑的靈敏度和病毒載量及病毒檢出率密切相關(guān)。當(dāng)病毒載量低的時(shí)候,若試劑盒靈敏度不夠,容易出現(xiàn)假陰性,造成漏檢,而當(dāng)換一個(gè)高靈敏度的試劑盒時(shí),則出現(xiàn)了所謂的“陰轉(zhuǎn)陽”,但其實(shí)只是更高的靈敏度試劑盒檢出了低病毒載量。因此結(jié)合上述提到的病毒載量隨時(shí)間進(jìn)程變化,應(yīng)注意采樣的時(shí)間,以及選擇合適的試劑盒,同時(shí)要定期監(jiān)測(cè)病毒載量變化。

  實(shí)驗(yàn)室污染:上述已介紹過在實(shí)驗(yàn)過程中,會(huì)搭配兩種陽性質(zhì)控來保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。但如果陽性質(zhì)控暴露造成實(shí)驗(yàn)室污染,則會(huì)出現(xiàn)假陽性。所以實(shí)驗(yàn)過程中一定要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控實(shí)驗(yàn),隨時(shí)監(jiān)測(cè)陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控的變化,以此來及時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室污染而采取必要的消殺措施。

  人類和病毒的戰(zhàn)爭(zhēng)從未停止,面對(duì)像新冠這類新出現(xiàn)的而且容易變異的病毒,即使有再先進(jìn)的醫(yī)學(xué)技術(shù),也往往需要時(shí)間和經(jīng)驗(yàn)的不斷積累才能漸漸得窺全貌。相信和尊重科學(xué),保持求知探索,同時(shí)給予醫(yī)護(hù)工作者和科學(xué)家們充分的支持和耐心,是我們每個(gè)人的責(zé)任。

  -End-

  參考:

  1、Presence of mismatches between diagnostic PCR assays and coronavirus SARS-CoV-2 genome.https://doi.org/10.1098/rsos.200636

  2、Lauren M. Kucirka etc, Variation in False-Negative Rate of Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction–Based SARS-CoV-2 Tests by Time Since Exposure, Annals of InternalMedicine, Aug, 2020

  3、SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients, Lirong Zou, Feng Ruan, N Engl J Med. 2020 Mar 19; 382(12): 1177–1179. doi: 10.1056/NEJMc2001737

  4、Rosanna W Peeling, David L Heymann, Yik-Ying Teo, Patricia J Garcia, Diagnostics for COVID-19: moving from pandemic response to control,Lancet 2022; 399: 757–68
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